三七_三七总皂苷抗炎作用

　　三七是五加科人参属植物，传统用于止血化瘀、消肿镇痛。近年发现其主要有效成分三七总皂苷[saponins of Panax pseudo-ginseng var.notoginseng（Burk.）Hoo et Tseng，PnS]对多种实验性炎症模型具有良好的抗炎活性。鉴于O-2等自由基诱发的脂质过氧化损伤是炎症发生发展的重要病理机制之一；加之近年研究发现胞内第二信使分子环磷酸腺苷（cA MP）升高具有抑制自由基释放的作用，为此，本研究以交叉菜胶（Car）诱导大鼠气囊滑膜炎为模型，以地塞米松为阳性对照，进一步观察了PnS的抗炎作用及其机制，旨在为发掘有效抗炎药提供理论依据。

　　 1 材料与方法

　　 1.1 药品与试剂：PnS（纯度99%，中国科学院昆明植物研究所提供）；地塞米松（Dex，卫生部药品检定所）；角叉菜胶（Car，辽宁药物研究所）；硫代巴比妥（TBA，上海试剂二厂）；十二炕基磺酸钠（日本进口分装）；四乙氧基丙烷（瑞典产品）；细胞色素C（Ⅲ 型，Sigma公司）；A23187（Sigma公司）；cAMP放免分析药盒（上海第二医学院）；其它试剂均为国产分析纯。

　　 1.2 实验动物处理：雄性Wistar大鼠，体重（185±34）g，第三军医大学实验动物中心提供（医动字第24301050号）。随机将大鼠分为6组：正常组、致炎组、Car+PnS60，120，240mg/kg3个组、Car+Dex 1mg／kg组。药物处理组于Car致炎前30min及致炎后6h分别ip相应药物，对照组给予等容量溶媒，各组大鼠于Car致炎后12h脱颈椎处死，用无钙镁Hank`s液（HBSS）灌洗，收集灌洗液进行有关指标测定。

　　1.3 大鼠气囊滑膜炎模型复制：参照文献方法进行。气囊内注射Car25mg/kg致炎，各组动物处死后，用HBSS灌洗气囊，收集灌洗液，少许行白细胞计数及分类计数，其余离心，分别收集上清液和白细胞（Typan blue检查白细胞活力大于97％，Neu占约95%），供各项指标测定。

　　1.4 白细胞计数及分类计数：按常规法进行。

　　1.5 灌洗液中蛋白含量的测定：按Lowry法进行。

　　1.6 灌洗液中脂质过氧化物丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量测定：参照向荣等硫代巴比妥酸分光光度法进行。

　　1.7 Neu释放O-2的测定：参照文献方法略加改进。取已制备好的细胞悬液，用HBSS调整成5×105/mL，各取悬液0.2mL，加入HBSS0.3mL，置37℃振荡孵育15min，立即置于冰浴中，加HBSS 1.5mL，离心（4℃，3000×g，5min），弃沉淀，上清液于550nm处测定A值。对照管不加刺激剂，余与测定管相同。按下列公式计算细胞色素C减少量，以代表O-2生成量。

　　对照管A-测定管A

　　Cyt C 减少量= -------------------

　　消光系数ε×时间t

　　ε=21.0L/mmol·cm

　　最后结果以Cyt C减少量（nmol/106 cells／5min）间接代表O-2释放量。

　　1.8 Neu内cAMP含量的测定：参照文献方法进行样品处理及测定。（1）样品处理：取细胞悬液（1×106／mL）1mL，于已硅化试管中，于100℃水浴煮沸3min，立即冰浴冷却，3000r/min离心10min，取上清于另一试管中，真空干燥待测。（2）测定：具体操作方法按cAMP放免药盒说明书进行。结果以pmol/106 cell表示。

　　1.9 统计分析：将各组数据在电子计算机上进行t检验和相关显著性检验，结果用均数±标准差（x±s）表示。

　　2 结果

　　2.1 PnS对灌洗液白细胞数及蛋白含量的影响：Car致炎前30min及致炎后6h，分别ip P

　　nS 60，120，240mg／kg及Dex 1mg/kg，于Car致炎后12h活杀大鼠，收集灌洗液进行测定。PnS3个剂量组均能一定程度地降低灌洗液中白细胞数（P＜0.01），且呈剂量依赖性。Dex具有类似作用（见表1）。

　　表1 PnS对灌洗液白细胞数及蛋白含量的影响

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　　组别剂量 Neu 蛋白

　　（mg/kg）（1×109/L）（g/L）

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　　正常组 - 2.95±0.54 0.59±0.20

　　致炎组 - 47.9±15.3△△ 7.46±1.26△△

　　Car+PnS 60 30.3±9.5△△** 7.41±1.55△△

　　120 21.2±7.2△△** 5.70±1.47△△*

　　240 17.0±6.2△△** 4.41±1.35△△*

　　Car+Dex 1 16.9±7.0△△** 5.39±1.20△△**

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　　与正常组比较：△△P＜0.01

　　与致炎组比较：* P＜0.05 **P＜0.01

　　2.2 对灌洗液中MDA含量的影响：Car致炎后，大鼠气囊灌洗液中MDA含量明显升高（P＜ 0.01），PnS 60，120，240mg／kg剂量依赖性阻止灌洗液中MDA含量的升高，其抑制率分别为：2.75％，33.10%，37.95%，Dex也具有类似作用（见表2）。

　　表2 PnS对灌洗液中MDA含量、Neu释放O-2及Neu内cAMP含量的影响（x±s，n=8）

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　　组别剂量 MDA O-2 cAMP

　　（mg/kg） (nmol/mL) （nmol/106cell·15min）（pmol/106 cell）

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　　正常组 - 7.26±2.59 34.58±6.29 1.960±0.460

　　致炎组 - 29.0±8.6△△ 116.8±11.1△△ 0.725±0.216△△

　　Car+PnS 60 28.2±7.4△△ 104.9±12.3△△ 0.665±0.195△△

　　120 19.4±5.6△△ 81.8±8.3△△** 1.247±0.547△*

　　240 18.1±5.7△△** 68.4±6.3△△** 1.823±0.520**

　　Car+Dex 1 16.3±4.7△△** 67.8±8.4△△** 1.414±0.503△**

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　　与正常组比较：△P<0.01，△△P<0.01；与致炎组比较：*P<0.05，**P<0.01

　　2.3 对灌洗液中Neu释放O-2的影响：由表2可见，Car致炎后，灌洗液Neu释放O-2显著增加，PnS3个剂量组均能抑制Neu释放O-2，且呈剂量依赖性，其抑制率分别为10.19％，29.96％，41.43％。

　　2.4 对灌洗液中Neu内cAMP含量的影响：由表2可见，Car致炎后，灌洗液Neu内cAMP含量明显降低（P＜0.01）；PnS能剂量依赖性地增加Neu内cAMP含量，且其大剂量组能使Neu内cAMP含量恢复到正常水平。Dex也具有类似作用。

　　3 讨论

　　自由基是广泛存在于生物体组织细胞内的非特异性损伤因素，也是炎症发生发展的重要病理机制之一。炎症时，活化的白细胞呼吸暴发过程产生的O-2等活性氧自由基，不仅具有增加血管通透性的作用，而且极易与生物膜的多不饱和脂肪酸发生脱氢反应，从而诱发组织细胞的脂质过氧化损伤。本实验结果发现，PnS3个剂量组均能剂量依赖性地抑制Car致炎大鼠Neu释放O-2、降低灌洗液中脂质过氧化物MDA的含量，且与其降低Neu数量及蛋白含量呈平行性变化。这与Pns对体外多形核白细胞呼吸暴发时产生的氧自由基及黄嘌吟氧化酶体系产生的O-2均具有清除作用的结果相一致。

　　细胞内的第二信使分子cAMP在调控炎症发生发展中具有重要作用，胞内升高的cAMP可抑制炎细胞释放自由基而产生抗炎活性。本实验观察到，Car致炎后，气囊灌洗液中Neu内cAMP含量明显下降（P＜0.01＝，PnS3个剂量组均能剂量依赖性升高Neu内cAMP含量，相关分析结果显示，PnS升高Neu内cAMP含量与其抑制Neu释放O-2呈显著负相关（r=-0.9384，P＜0.01＝。上述结果表明，升高Neu内cAMP从而抑制Neu释放O-2、减轻脂质过氧化损伤是PnS发挥抗炎作用的重要分子机制之一。